人體利用T細(xì)胞通過協(xié)調(diào)先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，選擇性地識別和殺死外部病原體和不健康細(xì)胞，包括癌細(xì)胞。程序性細(xì)胞死亡1(PD-1)受體是活化T細(xì)胞表面表達(dá)的關(guān)鍵抑制性免疫檢查點蛋白。其程序性死亡配體1(PD-L1)，又稱B7-H1，常見于多種細(xì)胞類型，包括T細(xì)胞，B細(xì)胞，單核細(xì)胞，抗原遞呈細(xì)胞((APC)和上皮細(xì)胞。癌細(xì)胞可以通過利用各種免疫檢查點來逃脫免疫檢測和消除。在各種實體腫瘤或腫瘤微環(huán)境中的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中具有PD-L1的過度表達(dá)現(xiàn)象。腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1和活化T細(xì)胞上的PD-1受體的相互作用可以抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞。一直以來，PD-L1在腫瘤中的高度表達(dá)與癌癥患者的不良臨床預(yù)后也密切相關(guān)。隨著癌癥免疫治療的發(fā)展，阻斷劑PD-L1/PD-1相互作用或下調(diào)PD-L1在癌細(xì)胞中的表達(dá)可以增強抗腫瘤免疫活性以及抑制腫瘤生長已引起廣泛關(guān)注。最近一些針對PD-1/PD-L1的免疫治療藥物，包括納武利尤單抗、阿替唑利單抗等，得到了美國食品和藥物管理局的批準(zhǔn)，這些藥物徹底改變了癌癥患者包括PD-L1高度表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC）的治療。

眾所周知，各種經(jīng)典的化學(xué)治療藥物除了對癌細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性作用外，還可以通過改變腫瘤的微環(huán)境來激活免疫反應(yīng)。據(jù)報道，環(huán)磷酰胺可以減少疫苗模型以及臨床前過繼性T細(xì)胞中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(TReg)，這可能會加強患者的免疫治療。其他一些可以減少髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)的細(xì)胞毒性化學(xué)治療藥物，例如5-氟尿嘧啶、吉西他濱和紫杉烷類也已被報道。另外，在報道中一些化療方案可以通過改變免疫系統(tǒng)來增強免疫檢查點阻斷劑的抗癌反應(yīng)。組蛋白去乙酰化酶抑制劑與CTLA-4或PD-1阻滯劑協(xié)同作用，可以根除小鼠模型中的原發(fā)腫瘤和其轉(zhuǎn)移。此外，新輔助化療能刺激腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TILs)，并上調(diào)腫瘤患者腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)也已得到證明。因此，以這些具有免疫刺激特性的化療藥物作為候選藥物，增加癌細(xì)胞的免疫原性，并隨后擴(kuò)大抗PD-L1治療的好處是十分可取的。

在本研究中，符立梧教授課題組評估了幾種常規(guī)化療藥物對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響。絲裂霉素(MMC)與PD-L1抗體在體內(nèi)外均具有協(xié)同作用。與單藥治療相比，MMC+PD-L1抗體聯(lián)合治療能有效增加腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(Til)數(shù)量，促進(jìn)T細(xì)胞分泌細(xì)胞毒血清蛋白酶誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。此外，聯(lián)合治療也能提高NSCLC細(xì)胞中MHC-I的表達(dá)。通過MMC處理后的腫瘤組織中Til顯著增加，PD-L1和MHC-I水平升高，也證實了體外研究結(jié)果。從機(jī)理上來講，MMC能夠激活ERK通路，隨后促進(jìn)c-JUN與PD-L1啟動子的結(jié)合，并募集其輔助因子STAT3加強PD-L1的表達(dá)。此外，ERK通路的上調(diào)也可以通過激活p65來增加MHC-I的表達(dá)。綜上所述，這是首次對經(jīng)典化療藥物MMC針對PD-L1檢查點抑制劑在NSCLC中抗腫瘤作用的影響進(jìn)行系統(tǒng)探究。該研究成果已發(fā)表在Signal Transduction and Targeted Therapy期刊上，IF=13.493。博士后羅敏為第一作者，符立梧教授為該文章的通訊作者。

基本信息

題目：

Mitomycin C enhanced the efficacy of PD-L1 blockade in non-small cell lung cance

期刊：Signal Transduction and Targeted Therapy

影響因子：13.493

PMID：32855386

通訊作者：符立梧

作者單位：中山大學(xué)腫瘤防治中心等

索萊寶合作產(chǎn)品：

產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號
Lactate Dehydrogenase (LDH) Assay Kit	BC0685

研究背景及摘要

程序性死亡配體1(PD-L1)免疫檢查點抑制劑對于腫瘤治療具有廣泛的應(yīng)用前景，但其有效率<20%。而一些化療藥物可以激活抗癌免疫反應(yīng)來殺死癌細(xì)胞同時還具有直接的細(xì)胞毒性。作者這項研究旨在于探討將化療藥物與PD-L1抗體聯(lián)合應(yīng)用以達(dá)到提高PD-L1阻斷劑靈敏度的效果。作者將采用絲裂霉素C(MMC)預(yù)處理的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞與外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)共同培養(yǎng)，用于探究MMC與PD-L1抗體聯(lián)合作用的效果。這組聯(lián)合藥物的療效也在C57BL/6小鼠體內(nèi)的Lewis肺癌(LLC)細(xì)胞中進(jìn)行了研究。結(jié)果表明MMC可增強體內(nèi)外NSCLC細(xì)胞中PD-L1和MHC-I的表達(dá)，增強淋巴細(xì)胞對NSCLC的細(xì)胞毒作用。在載有LLC的小鼠模型中，MMC和PD-L1抗體聯(lián)合應(yīng)用比單獨應(yīng)用時更能有效地抑制腫瘤生長以及延長總生存率，這一現(xiàn)象與淋巴細(xì)胞浸潤和顆粒酶B釋放的增加有關(guān)。從機(jī)制上來講，MMC激活ERK通路，隨后增強c-JUN與PD-L1啟動子的結(jié)合，并通過募集其輔因子STAT3以增加PD-L1的表達(dá)。上調(diào)的ERK通路也通過激活的p65強化了MHC-I的表達(dá)。MMC可以增強PD-L1阻斷劑對NSCLC細(xì)胞的作用。進(jìn)一步將研究結(jié)果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的研究也是十分必要的。

研究內(nèi)容及結(jié)果

1. MMC處理后腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)上調(diào)

在非細(xì)胞毒性濃度下使用幾種常規(guī)化療藥物將三種NSCLC細(xì)胞(A549、H1299和H460)處理48h后，對細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMC在三種NSCLC細(xì)胞中均能夠使PD-L1的表達(dá)持續(xù)增加。為了驗證MMC對PD-L1的上調(diào)是否是一種普遍現(xiàn)象，在不同癌癥類型的更多癌細(xì)胞中，對不同濃度和時間的MMC處理進(jìn)行了探究。在NSCLC和所有測試的癌細(xì)胞中，MMC對PD-L1表達(dá)的顯著上調(diào)呈現(xiàn)出了對MMC處理濃度和時間的相關(guān)性。

2. PD-L1阻斷劑和MMC的結(jié)合產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用

為了確定MMC上調(diào)PD-L1表達(dá)是否會影響抗腫瘤免疫活性，用MMC預(yù)處理H460細(xì)胞24h，然后與PBMC共培養(yǎng)24h。結(jié)果表明與未用MMC預(yù)處理的細(xì)胞相比，用MMC預(yù)處理的H460細(xì)胞細(xì)胞裂解數(shù)量更多。此外，MMC預(yù)處理且PBMCs孵育后的H460細(xì)胞CD³⁺T細(xì)胞群體中TNF-α水平明顯升高。這些結(jié)果表明，MMC增強了T細(xì)胞的活化。為了驗證PD-L1參與MMC和PD-L1聯(lián)合阻斷的增強抗癌作用，作者建立了穩(wěn)定的PD-L1敲除的PD-L1/KO-H460細(xì)胞。通過對PD-L1抗體處理后的Giemsa染色，將進(jìn)行或未進(jìn)行MMC預(yù)處理過的PD-L1/KOH460細(xì)胞和野生型對照H460細(xì)胞中T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷力進(jìn)行了探究。在野生型H460和PD-L1/KO H460細(xì)胞中，MMC和PD-L1抗體的聯(lián)合作用均明顯高于MMC或PD-L1抗體，而在PD-L1/KO H460細(xì)胞中觀察到了更明顯的效果。顆粒酶B是一種絲氨酸蛋白酶，可介導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的凋亡作用。重要的是，與未預(yù)處理的H460細(xì)胞相比，MMC預(yù)處理且PBMC孵育后H460細(xì)胞的CD⁸⁺釋放出更多的顆粒酶B。為了探究MMC和PD-L1抗體在體內(nèi)的聯(lián)合抗癌作用，在C57BL/6小鼠側(cè)翼建立Lewis肺癌模型。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100mm³時，隨機(jī)的將小鼠進(jìn)行MMC單獨處理，PD-L1抗體單獨處理，MMC與PD-L1聯(lián)合抗體、生理鹽水+同型對照IgG腹腔注射處理。與IgG治療的對照組和其他單藥組相比，MMC和PD-L1聯(lián)合抗體可使得腫瘤生長更加延緩。MMC和PD-L1聯(lián)合抗體也是四個處理組中存活率最佳的。

3. MMC增加了MHC-I在腫瘤組織中的表達(dá)

為了探討經(jīng)PD-L1抗體處理后MMC對T細(xì)胞反應(yīng)的增強作用，測定了C57BL/6腫瘤組織中腫瘤浸潤T細(xì)胞的數(shù)量及其活性。免疫組化染色顯示，MMC和PD-L1抗體聯(lián)合處理后CD³⁺和CD⁸⁺T細(xì)胞浸潤腫瘤的數(shù)目明顯高于兩個單一處理。另外，在聯(lián)合抗體處理組中T細(xì)胞活化標(biāo)記顆粒酶B也明顯增加。為了探討TILs增加的機(jī)理，作者檢測了幾種參與T細(xì)胞活化的共刺激或共抑制分子。腫瘤細(xì)胞能夠通過下調(diào)I類主要組織相容性復(fù)合物(MHC-I)的表達(dá)來逃避細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)，這對于識別和隨后的殺傷效果是必需的。為此，MMC處理48h后，NSCLC細(xì)胞中PD-L1的上調(diào)伴隨著MHC-I的表達(dá)增加。事實上，MMC也被發(fā)現(xiàn)NSCLC細(xì)胞中MHC-I的表達(dá)與MMC處理濃度和時間的增加具有相關(guān)性。然而，作者檢測了MMC處理后PD-L1和MHC-I在兩個正常細(xì)胞(HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)和NCM460(正常來源的結(jié)腸粘膜細(xì)胞))中的表達(dá)。結(jié)果表明PD-L1和MHC-I的表達(dá)都沒有受到MMC的影響。MHC-I在H1299和H460細(xì)胞表面的表達(dá)被MMC提高。為了進(jìn)一步證實這一結(jié)果，作者對MMC處理前后患者腫瘤標(biāo)本中TILs的改變進(jìn)行了研究。結(jié)果表明MMC處理后腫瘤組織PD-L1和MHC-I的表達(dá)升高。而在MMC處理后，腫瘤組織中CD³⁺和CD⁸⁺浸潤淋巴細(xì)胞的數(shù)量也明顯增加。

4. MMC通過激活p65增加MHC-I的表達(dá)

用MMC(0.4μM)處理48h的NSCLC細(xì)胞(H1299和H460)中MHC-I mRNA水平顯著升高。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是細(xì)胞對炎癥刺激反應(yīng)的的重要介質(zhì)。為此，NF-κB p65能夠?qū)HC-I和PD-L1的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控已被報道。作者探究了MMC處理48h后NSCLC細(xì)胞NF-κB p65亞單位表達(dá)的影響。結(jié)果表明MMC處理后，p65及其磷酸化形式p-p65均增加。熒光素酶報告試驗數(shù)據(jù)表明，p65顯著上調(diào)了MHC-I和PD-L1啟動子驅(qū)動的熒光素酶活性。此外，p65的過表達(dá)可提高NSCLC細(xì)胞中MHC-I和PD-L1的mRNA和蛋白水平。另一方面，p65壓制也降低了MHC-I和PD-L1的蛋白表達(dá)。為了研究p65對于MMC誘導(dǎo)的MHC-I和PD-L1上調(diào)來講是否是必需的，對p65敲除后的H1299或H460細(xì)胞采取MMC處理，然后觀察MHC-I和PD-L1的蛋白表達(dá)。結(jié)果表明雖然在對照細(xì)胞中MMC能夠誘導(dǎo)p65、MHC-I和PD-L1的表達(dá)，但p65的敲除可以減弱MMC對MHC-I和PD-L1的上調(diào)的誘導(dǎo)。NF-kB/p65轉(zhuǎn)錄的激活需要TNF-α。為了驗證MMC誘導(dǎo)的MHC-I和PD-L1上調(diào)與p65是否激活的關(guān)系，采用MMC或TNF-α處理H460/H1299細(xì)胞，檢測處理后細(xì)胞中MHC-I和PD-L1的p65磷酸化和表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SC-75741(一種阻止p65轉(zhuǎn)錄活性的抑制劑)能夠抑制MMC對H1299和H460中MHC-I表達(dá)。相反，在SC-75741存在下，MMC對PD-L1表達(dá)的上調(diào)沒有影響，表明MMC誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)的上調(diào)與p65的轉(zhuǎn)錄活性無關(guān)。

5. c-JUN的激活使得MMC增加PD-L1的表達(dá)

經(jīng)過MMC處理48h后，NSCLC細(xì)胞(A549、H1299和H460)中PD-L1 mRNA水平顯著升高。在H1299細(xì)胞中PD-L1蛋白穩(wěn)定性且不受MMC處理的影響。為了研究MMC對PD-L1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對具有pGL3-堿性熒光素酶結(jié)構(gòu)的293T細(xì)胞進(jìn)行了熒光素酶報告基因檢測，該結(jié)構(gòu)含有4個不同的進(jìn)行性5’缺失的PD-L1啟動子區(qū)域。最長的PD-L1啟動子序列(p868)在四個啟動子區(qū)中表現(xiàn)出最高的熒光素酶活性。這一發(fā)現(xiàn)表明，PD-L1啟動子區(qū)域內(nèi)的核心元素(?762至?587bp)是驅(qū)動轉(zhuǎn)錄和觀察熒光素酶活性的關(guān)鍵。根據(jù)PROMO和JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測少數(shù)候選轉(zhuǎn)錄因子(包括c-JUN、STAT4和FOXP3)與核心PD-L1啟動子元件結(jié)合，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄。為了進(jìn)一步證實與PD-L1核心啟動子結(jié)合并驅(qū)動其轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子(S)的同一性，將表達(dá)載體(pCDNA3.1/c-JUN、STAT4或FOXP3)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用含有核心PD-L1啟動子區(qū)的熒光素酶構(gòu)建物(?762至?587bp)重復(fù)熒光素酶報告基因檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有pCDNA3.1/c-JUN具有激活PD-L1啟動子驅(qū)動的熒光素酶活性。此外，當(dāng)從PD-L1啟動子核心啟動子區(qū)(DeltA)中刪除c-JUN結(jié)合位點時，PD-L1啟動子驅(qū)動的熒光素酶活性下降到基線水平。在H460細(xì)胞中進(jìn)行CHIP檢測，使用抗c-JUN抗體對PD-L1染色質(zhì)進(jìn)行免疫沉淀，發(fā)現(xiàn)MMC處理后c-JUN與核心PD-L1啟動子區(qū)域的關(guān)聯(lián)顯著增加。采用同型對照兔IgG作為陰性對照進(jìn)行免疫沉淀。為了證明CHIP檢測的特異性，對c-JUN和RNA聚合酶II與組成型GAPDH啟動子的結(jié)合與核心PD-L1啟動子進(jìn)行分析。使用正常IgG時，未從免疫沉淀樣品中獲得PCR信號。用RNA聚合酶II插入染色質(zhì)檢測RNA聚合酶II與GAPDH和PD-L1啟動子的結(jié)合時，發(fā)現(xiàn)c-JUN是與免疫沉淀染色質(zhì)中的核心PD-L1啟動子特異性結(jié)合的。研究表明轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D能夠抑制MMC對PD-L1上調(diào)的誘導(dǎo)。因此，c-JUN與PD-L1基因啟動子結(jié)合很可能使得PD-L1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄性上調(diào)。為了證實c-JUN作為轉(zhuǎn)錄因子起到調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞中PD-L1基礎(chǔ)表達(dá)的作用，作者將shRNAs敲除c-JUN。在c-JUN基因敲除的腫瘤細(xì)胞中，mRNA和PD-L1蛋白水平均顯著降低。作者通過檢測處理48h后的A549和H460細(xì)胞中c-JUN的表達(dá)，進(jìn)一步探討了c-JUN在MMC介導(dǎo)的PD-L1表達(dá)上調(diào)中的作用機(jī)理。發(fā)現(xiàn)通過MMC處理，mRNA和c-JUN蛋白水平均顯著升高。在MMC處理后，激活形式的磷酸鹽也顯著增加。在c-JUN-敲除的NSCLC細(xì)胞(A549和H460)中，MMC對PD-L1上調(diào)的誘導(dǎo)消失。

6. C-JUN與它的輔助因子STAT3協(xié)調(diào)作用使得PD-L1上調(diào)

在之前的研究報道中，c-JUN與STAT3相互作用形成一個復(fù)合物來調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)。為了研究STAT3是否參與了MMC誘導(dǎo)的PD-L1上調(diào)，檢測在MMC處理后的H1299和H460細(xì)胞中STAT3的表達(dá)。MMC可提高NSCLC細(xì)胞中的mRNA和STAT3蛋白水平。在STAT3敲除的細(xì)胞中MMC對PD-L1表達(dá)的誘導(dǎo)消失。與這個發(fā)現(xiàn)一致的是，在硝呋酚酰肼(一種阻止STAT3激活的抑制劑)的存在下，MMC未能上調(diào)NSCLC細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)。當(dāng)p-c-JUN和p-STAT3被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核以發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性時，來自MMC處理或未處理的H460細(xì)胞中的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)組分被分離和檢測。MMC處理后PD-L1細(xì)胞質(zhì)表達(dá)升高的同時，細(xì)胞質(zhì)和核中c-JUN和p-c-JUN表達(dá)升高。另一方面，在細(xì)胞核中STAT3(p-STAT3)的轉(zhuǎn)錄活性也上調(diào)。另外，MMC處理后H460細(xì)胞中c-JUN與STAT3的相互作用增強。表明MMC能調(diào)節(jié)c-JUN和STAT3的表達(dá)和相互作用，從而上調(diào)PD-L1在體外的表達(dá)。

7. MMC通過ERK信號誘導(dǎo)MHC-I和PD-L1表達(dá)

MMC通過激活ERK PD-L1和MMC刺激MHC-I和PD-L1的表達(dá)主要通過兩個主要機(jī)制控制，即IFN-γ依賴和獨立的方式。為了驗證IFN-γ信號是否參與了MMC對PD-L1表達(dá)的上調(diào)，對轉(zhuǎn)染對照shRNA或IFNGR1 shRNA的A549和H460細(xì)胞進(jìn)行或不進(jìn)行MMC處理。在MMC處理后的對照和IFNGR1基因敲除的細(xì)胞(A549和H460)中PD-L1、c-JUN、STAT3的表達(dá)及其膦酸鹽形式均增加。另一方面，雖然IFN-γ能夠顯著增加PD-L1的表達(dá)，但這種作用在IFNGR1基因敲除細(xì)胞中消失。因此，MMC處理后PD-L1的增加是由c-JUN/STAT3信號通路介導(dǎo)的，而不是通過IFN-γ依賴性的方式介導(dǎo)的。據(jù)報道，MMC通過ERK和JNK信號增加了c-JUN的活性。此外，p65是MAPK通路激活的下游轉(zhuǎn)錄因子。因此，MMC對p-ERK1/2和p-JNK蛋白水平存在影響。在H1299和H460細(xì)胞中，MMC均使得ERK和JNK的磷酸化升高。為了進(jìn)一步闡明ERK和JNK信號的參與，研究了MEK抑制劑(U0126)或JNK抑制劑(SP600125)對MMC誘導(dǎo)的PD-L1和MHC-I表達(dá)上調(diào)的影響。雖然MMC誘導(dǎo)PD-L1和MHC-I表達(dá)不受SP600125的影響，但U0126顯著降低了MMC對PD-L1和MHC-I表達(dá)上調(diào)的誘導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)表明ERK通路的激活在MMC上調(diào)NSCLC細(xì)胞中MHC-I和PD-L1中起著至關(guān)重要的作用。

研究結(jié)論和意義

在本研究中，MMC可上調(diào)NSCLC中PD-L1和MHC-I的表達(dá)，增強PD-L1阻斷劑在體外和體內(nèi)的療效，這與腫瘤腫塊中TILs的增加以介導(dǎo)抗腫瘤免疫有關(guān)。c-JUN的激活和c-JUN與STAT3之間的相互作用增加均通過ERK信號介導(dǎo)PD-L1表達(dá)的上調(diào)。另一方面，p65的激活也會使得MHC-I增加。綜上所述，本研究倡導(dǎo)將PD-L1抗體與MMC進(jìn)行結(jié)合以提高PD-1/PD-L1免疫治療NSCLC的治療效果。

索萊寶產(chǎn)品亮點

LDH assay in H460 cells pretreated with

MMC(0.4 μM, 24 h). 

Effector cell (E): PBMC   Target cell (T): H460

相關(guān)產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號
Hexokinase(HK) Activity Assay Kit	BC0740
Hexokinase(HK) Activity Assay Kit	BC0745
Pyruvate Kinase(PK) Activity Assay Kit	BC0540
Pyruvate Kinase(PK) Activity Assay Kit	BC0545
Phosphoenolpyruvate Carboxylase (PEPC) Activity Assay Kit	BC2190
Phosphoenolpyruvate Carboxylase (PEPC) Activity Assay Kit	BC2195
Pyruvate(PA) Content Assay Kit	BC2200
Pyruvate(PA) Content Assay Kit	BC2205
Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase(GAPDH) Activity Assay Kit	BC2210
Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase(GAPDH) Activity Assay Kit	BC2215
Lactic Acid(LA) Content Assay Kit	BC2230
Lactic Acid(LA) Content Assay Kit	BC2235
Phosphoglycerate Kinase(PGK) Activity Assay Kit	BC2250
Phosphoglycerate Kinase(PGK) Activity Assay Kit	BC2255
Fructose-bisphosphate aldolase(FBA) Activity Assay Kit	BC2270
Fructose-bisphosphate aldolase(FBA) Activity Assay Kit	BC2275
Fructose-1，6-diphosphate(FDP) Assay Kit	BC2240
Fructose-1，6-diphosphate(FDP) Assay Kit	BC2245
Lacate Dehydrogenase(LDH) Activity Assay Kit	BC0680
Lacate Dehydrogenase(LDH) Activity Assay Kit	BC0685