在中國，真正的思想家是門衛(wèi)大爺，因為他每次都要問你哲學(xué)上的三個終極問題：“你是誰？”“你從哪里來？”“你要到哪里去？”。這三個問題不僅僅是門衛(wèi)大爺在想，哲學(xué)家，科學(xué)家也都在思索與追溯。本著跟門衛(wèi)大爺學(xué)習(xí)的態(tài)度，今天跟大家追溯的是索萊寶公司在做，植物領(lǐng)域科學(xué)家們用來進(jìn)行植物基因功能研究的“螺旋槳”——植物抗體（Antibody for Plant Research）。
植物抗體的三個終極問題
◆ 植物抗體是什么？
植物抗體是植物細(xì)胞自身合成與分泌的物質(zhì)嗎？還是動物細(xì)胞合成與分泌的物質(zhì)，可用于特異性結(jié)合植物蛋白或多肽等？
答案顯然是后者。雖然植物具有和人/動物類似的先天免疫系統(tǒng)（innate immune system），比如PTI、ETI，但是還沒有研究報道，植物擁有類似于人/動物的獲得性免疫系統(tǒng)（adaptive immune system）。尤其是，還沒發(fā)現(xiàn)類似于人/動物B淋巴細(xì)胞或漿細(xì)胞的植物細(xì)胞，因而植物不能同人或動物那樣產(chǎn)生并分泌抗體。
圖1 植物抗體分子結(jié)構(gòu)模型
一般而言，抗體是人體或脊椎動物獲得性免疫系統(tǒng)中漿細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白，其產(chǎn)生需要細(xì)菌、病毒、植物蛋白等抗原物質(zhì)的誘導(dǎo)與刺激，是由兩條相同的重鏈與兩條相同的輕鏈構(gòu)成的“Y”字形結(jié)構(gòu)分子（如圖1）。那么植物抗原與植物抗體的關(guān)系是怎樣的呢？我們知道，目前世界各地都在為獲取充足的新冠疫苗而努力，使人體產(chǎn)生對抗新冠病毒的抗體，因而，植物抗原與植物抗體的關(guān)系就如同COVID-19滅活疫苗與人體分泌的COVID-19抗體。要想進(jìn)一步深入理解植物抗體是什么，還有賴于對后面兩個終極問題的認(rèn)識與理解。
◆ 植物抗體從哪里來？
正如注射新冠疫苗使人體產(chǎn)生對抗病毒的抗體，植物抗體的獲得同樣需要制備植物蛋白或多肽等，用于免疫動物（小鼠、兔子等），使其合成并分泌對抗對應(yīng)的植物抗原的抗體。那么植物抗體產(chǎn)生的一般過程又是怎樣的？
首先，根據(jù)植物基因/蛋白注釋數(shù)據(jù)庫（比如，Uniprot、NCBI、TAIR、MSU-RGAP、Gramene等），獲取對應(yīng)的植物蛋白/多肽的全長氨基酸序列及其相關(guān)信息（比如，同源蛋白、可變剪切體、亞細(xì)胞定位、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、修飾化位點等）。利用Swiss-Model、TMHMM、IEDB、abcpred、AbDesigner、DNAstar等軟件與分析工具，預(yù)測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)并獲取抗原表位信息，從而選擇與設(shè)計出具有較強抗原性的氨基酸序列片段，用于制備重組蛋白（長度＞100 aa；通常利用E.coli等原核生物表達(dá)產(chǎn)生）或合成多肽（長度10-22 aa）并與載體耦聯(lián)（如KLH-多肽）。
圖2 植物抗體制備流程（鼠單抗或兔多抗）
以上述重組蛋白或KLH-多肽等作為植物抗原（或免疫原），對小鼠或兔子等動物進(jìn)行注射免疫，以獲取特異性植物抗體。通常選擇小鼠用于制備單克隆抗體，選擇兔子、羊等用于制備多克隆抗體。與多克隆抗體制備所不同的是，單克隆抗體需要效應(yīng)B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的過程，以獲得具有無限增殖能力的雜交瘤細(xì)胞；并進(jìn)行亞克隆篩選，獲取可產(chǎn)生單克隆抗體的陽性細(xì)胞株；然后將陽性細(xì)胞株注射到小鼠腹腔，以誘生大量單克隆抗體；隨后大量采集小鼠腹水，從中分離、純化抗體，并對抗體的質(zhì)量與應(yīng)用范圍進(jìn)行驗證評估。而多抗制備則是在動物免疫后，采集分離血清，分離純化抗體，并做應(yīng)用驗證即可。
◆ 植物抗體要到哪里去？
從新冠肺炎康復(fù)患者體內(nèi)分離的血清可用于治療新感染COVID-19的病人，換言之，COVID-19抗體可以用于抵抗與消滅新冠病毒，避免感染新冠肺炎。然而，制備植物抗體的目的，卻并不是用于或為了消滅植物蛋白或多肽等。在科研領(lǐng)域內(nèi)，最直接目的是用于識別與鑒定植物蛋白，以實現(xiàn)目的蛋白質(zhì)的定性/定量、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)互作、蛋白質(zhì)與核酸互作等（可繼續(xù)關(guān)注后續(xù)推文分享~），因而，植物抗體一般被用于WB、IP/Co-IP/IP-MS、Pull-down、免疫金標(biāo)記、CHIP/CHIP-seq、ELISA等實驗中。
下面以水稻線粒體蛋白ATP合酶β亞基（AtpB | Beta subunit of ATP synthase）為例，介紹索萊寶公司自產(chǎn)的一支植物抗體anti-AtpB的誕生過程：
背景介紹
線粒體內(nèi)膜表面有一層規(guī)則間隔排列著的球狀顆粒，稱為ATP酶復(fù)合體，即ATP合酶，是ATP（生命活動的能量“貨幣”）合成的場所。它主要由伸在膜外的親水部分F1（α3β3γδε亞基）和嵌入膜內(nèi)的疏水部分F0（a1b2c9-12亞基）兩部分組成（圖3）。
圖3 ATP合酶及ATP合成
在水稻中，ATP合酶β亞基的編碼基因為LOC_Os05g47980，由9個exons與8個內(nèi)含子構(gòu)成，CDS全長為1659 nt，蛋白長度552 aa，其亞細(xì)胞定位于線粒體內(nèi)膜。利用Swiss-Model預(yù)測其蛋白三維結(jié)構(gòu)（圖4），IEDB等預(yù)測抗原表位密集的肽段，選擇并設(shè)計目標(biāo)序列片段，用于重組蛋白表達(dá)，表達(dá)得到的蛋白免疫小鼠，以制備單克隆抗體。
圖4 水稻AtpB的基因結(jié)構(gòu)
及蛋白的亞細(xì)胞定位與3D結(jié)構(gòu)預(yù)測模型
抗體制備及抗體Anti-ATPB信息
索萊寶公司根據(jù)MSU-RGAP與Uniprot注釋的基因/蛋白序列信息，將設(shè)計出具有較強抗原性的序列片段通過原核生物表達(dá)獲得重組蛋白，然后以此作為免疫原，對小鼠進(jìn)行免疫，并將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選獲得單克隆雜交瘤細(xì)胞，最終生產(chǎn)純化獲得高效價的單克隆植物抗體Anti-ATPB。
|
貨號 |
P000002M |
|
名稱 |
Anti-ATPB Monoclonal Antibody for Plant |
|
規(guī)格 |
50 μL；100 μL |
|
抗體類型 |
鼠IgG |
|
克隆類型 |
單克隆抗體 |
|
預(yù)測 分子量大小 |
57 KD |
|
已驗證 交叉反應(yīng)物種 |
水稻、擬南芥、玉米、 小麥、大豆、煙草 |
|
儲存條件 |
-20℃ |
|
稀釋比例 |
WB（1:1000-3000） |
|
應(yīng)用 |
WB |
單抗Anti-ATPB的WB檢測結(jié)果（如圖5）
圖5 Anti-ATPB檢測結(jié)果
反應(yīng)條件詳細(xì)信息：
蛋白樣品：每孔25 μg總蛋白（加樣順序：水稻、擬南芥、玉米、大豆、煙草、小麥的葉片）
分離膠濃度：10% SDS-PAGE
轉(zhuǎn)膜：PVDF（0.45μm）轉(zhuǎn)膜1 hour
封閉：5%脫脂牛奶（室溫或4℃，1 hour）
一抗：4℃過夜，1:1000
二抗：室溫1小時，1:2000
曝光：ECL發(fā)光液
結(jié)論：利用水稻蛋白AtpB作為免疫原，獲得的抗體Anti-AtpB，不僅在水稻中，而且在其它植物，如擬南芥、玉米、大豆、煙草、小麥等均有反應(yīng)。表明此抗體在不同作物中具有廣泛的用途。
植物抗體定制服務(wù)
大多數(shù)植物蛋白缺乏可用抗體，需要量身定制抗體。為滿足科研工作者對抗體多樣化和深層次的科研需求，索萊寶提供從植物基因到科研抗體的制備與后續(xù)檢測驗證等一站式、全方位的解決方案與定制服務(wù)。本服務(wù)項目依托于先進(jìn)的研發(fā)平臺，專業(yè)的服務(wù)開發(fā)團(tuán)隊和國際知名品牌的儀器設(shè)備，為客戶植物抗體的定制與檢測服務(wù)提供了保障。
備注：以上每項服務(wù)既是獨立分項，可獨立完成；又是一站式全套服務(wù)，可打包整合為一整套的整體服務(wù)項目來完成。
多肽自產(chǎn)抗體及制備過程實例，可關(guān)注后續(xù)推文。
更多信息請關(guān)注：公司官網(wǎng)-。
