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小鼠巨噬細胞炎癥蛋白 3α ELISA 試劑盒

產(chǎn)品編號：SEKM-0116

適用于小鼠血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液等樣本

背景介紹：
       小鼠巨噬細胞炎癥蛋白 3α（MIP-3α），又稱 CCL 20，分子量為 8kDa，屬于 CC 趨化因子亞家族中的一員，該蛋白由 97 個氨基酸組成前體蛋白，其中包含有 27 個氨基酸組成的信號肽序列和 70 個氨基酸組成的成熟片段，成熟的小鼠 MIP-3α不含有 N-連接糖基化位點。小鼠 MIP-3α的成熟區(qū)分別與成熟大鼠和人
MIP-3α有 73%和 70%的氨基酸序列同源性，而與小鼠 MIP-3β的同源性僅為 34%。單核細胞、巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞、肥大細胞、中性粒細胞、角質(zhì)細胞、腸上皮細胞，成骨細胞，成纖維細胞，內(nèi)皮細胞和支氣管上皮細胞均可表達 MIP-3α，該趨化因子可特異性趨化朗格漢斯細胞（LC）向表皮或黏膜上
皮遷移，同時也具有趨化未成熟樹突狀細胞（DC）和淋巴細胞的功能，在炎癥及免疫性疾病發(fā)生過程中有重要作用。 

檢測原理：
       Solarbio ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將抗小鼠 MIP-3 α/CCL20 單克隆抗體包被在酶標板上；分別加入梯度稀釋的標準品和預(yù)稀釋的樣本，標準品和樣本中的小鼠 MIP-3α/CCL20 會與酶標板上的包被抗體充分結(jié)合；洗板后加入生物素化抗小鼠 MIP-3α/CCL20 抗體，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標準品和樣本中的小鼠 MIP-3α/CCL20 發(fā)生特異性結(jié)合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發(fā)生高強度的非共價結(jié)合；洗板后加入顯色劑底物 TMB，若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的小鼠 MIP-3α/CCL20，則 HRP 會使無色 TMB 變成不同深淺（正相關(guān)）的藍色物質(zhì)，加入終止液后反應(yīng)孔會變成黃色；*，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應(yīng)孔樣品吸光度（OD），樣本中的小鼠濃度與 OD 成正比，通過繪制標準曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計算出樣本中小鼠的濃度。


原理圖：

注意事項：
1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時應(yīng)保存在 2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標準品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復(fù) 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗中標準品和樣本建議作復(fù)孔檢測，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。
5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8. 為保證結(jié)果準確，每次檢測均需做標準曲線。 

安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作小鼠員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。


試劑盒組成及儲存：

自備實驗器材（不提供，可代購）
1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管

樣本收集及儲存：
1. 細胞培養(yǎng)上清：
將細胞培養(yǎng)基移至無菌離心管，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復(fù)凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高于標準品的*值，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實驗前做預(yù)實驗以確定稀釋倍數(shù)。 

試劑準備：
1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1000?8?6L至凍干標準品中，靜置15分鐘待其完全溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，按照以下濃度進行2倍稀釋：1000、500、250、125、62.5、31.25、0pg/ml進行稀釋。2000pg/ml作為標準曲線的*點濃度，標準品/樣本稀釋液（SR1）作為標準曲線的零點
（0pg/ml）。復(fù)溶過的標準品原液（2000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。

5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內(nèi)使用。

6. 洗滌方法：
自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔,注與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。
手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止30 秒后甩凈酶標板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。



結(jié)果判斷：
1.用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測，請用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。
2.計算標準品、樣品的平均 OD 值：每個標準品和標本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值。
3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中含量可通過對應(yīng)OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度。
4.若標本 OD 值高于標準曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù)。


參數(shù)表征：

1. 數(shù)據(jù)及標準曲線

本圖僅供參考，應(yīng)以當(dāng)次試驗標準品繪制的標準曲線計算小鼠 MIP-3α/CCL20 的樣本含量。

2. 靈敏度：
*可檢測小鼠 MIP-3α/CCL20 濃度達 8pg/ml，
20 個零標準品濃度 OD 的平均值加上兩個標準差，計算相應(yīng)的可檢測濃度。

3. 特異性：
不與小鼠 6Ckine、C10、CCL28、CTACK、Eotaxin、MIP-1α、MIP-1β反應(yīng)，人 MIP-3α、MIP-3β等反應(yīng)。

4. 重復(fù)性：
板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%。

5. 回收率：
在選取的健康小鼠血漿、細胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的小鼠 MIP-3α/CCL20 ，計算回收率。

6. 線性稀釋：
分別在選取的 4 份健康小鼠血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 ，在標準曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進行稀釋，評估線性。

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