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幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)試劑盒說明書
可見分光光度法
產(chǎn)地：北京市通州區(qū)馬駒橋聯(lián)東U谷85A三樓
英文名稱：Chitinase activity assay kit
產(chǎn)品商標(biāo)：solarbio
注意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。
貨號(hào)：BC0820
規(guī)格：50T/24S
保存與運(yùn)輸：4℃保存或-20℃保存；            
參考價(jià)格：800.00
庫存狀態(tài)：現(xiàn)貨
關(guān)鍵詞：幾丁質(zhì)酶|幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)|幾丁質(zhì)酶檢測(cè)
產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體80mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體40mL×1 瓶，4℃保存，使用前搖勻。
試劑二：液體15mL×1 瓶，4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1 瓶。5mg N-乙酰氨基葡萄糖，4℃保存。臨用前加入2.27mL 蒸餾水配成10μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

產(chǎn)品說明：
幾丁質(zhì)酶要存在于蝦、蟹、昆蟲等甲殼類動(dòng)物的外殼與軟體動(dòng)物的器官(例如烏賊的軟骨)，以及真菌類的細(xì)胞壁中。而幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)可催化幾丁質(zhì)水解，具有抵御真菌侵染的作用，成為抗真菌病害的研究熱點(diǎn)。
幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖，進(jìn)一步與3,5-二硝基水楊酸產(chǎn)生棕紅色化合物，在540nm 處有特征吸收峰，吸收值增加速率反映了幾丁質(zhì)酶的活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、水浴鍋、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)、1 mL 玻璃比色皿、研缽/勻漿器、蒸餾水。

操作步驟：
一、粗酶液提取
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.15g 組織，加入1.5mL 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000pm，4℃離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。
2. 真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500 萬細(xì)胞加入1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3s，間隔7s，總時(shí)間3min）；然后12000rpm，4℃，離心20min，取上清置于冰上待檢。
3. 培養(yǎng)液：直接測(cè)定。

二、測(cè)定操作表：
1、可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min。波長(zhǎng)調(diào)至540nm，蒸餾水調(diào)零。
2、將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為4、3、2.5、2、1μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。
3、在EP 管中分別加入：
試劑名稱                  測(cè)定管       對(duì)照管      標(biāo)準(zhǔn)管       空白管
樣品（mL）                 0.5           0.5         -             -
標(biāo)準(zhǔn)溶液（mL）             -             -          0.5            -
蒸餾水（mL）               -             -           -            0.5
試劑一（mL）              0.5             -          0.5           0.5
混勻，37℃水浴1h，沸水浴5min。
試劑一（mL）               -             0.5          -             -
8000rpm 常溫離心10min，分別取上清液0.8mL 于新的EP 管中。
試劑二（mL）              0.2            0.2          0.2            0.2
混勻，沸水浴反應(yīng)10min，立即置于冰上至室溫。測(cè)定每管在540nm 下的吸光度，記為A 測(cè)定管、A 對(duì)照管、A 標(biāo)準(zhǔn)管、A 空白管。計(jì)算ΔA 測(cè)定=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管，ΔA 標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管。

三、計(jì)算公式
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
以ΔA 標(biāo)準(zhǔn)為y 軸，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b。將ΔA 測(cè)定帶入標(biāo)準(zhǔn)方程中，得到x（μmol/mL）
2、幾丁質(zhì)酶活的計(jì)算：
（1）按照樣本重量計(jì)算
酶活性定義：37℃下，每g 組織每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活性單位。
幾丁質(zhì)酶活性（U/g 鮮重）=x×V 樣÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T=1.5×x÷W。
（2）按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算
酶活性定義：37℃下，每毫克蛋白每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活性單位。
幾丁質(zhì)酶活性（U/mg prot）=x×V 樣÷（V 樣×Cpr）÷T=x÷Cpr。
（3）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義：37℃下，每104 個(gè)細(xì)胞每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1μmolN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活性單位。
幾丁質(zhì)酶活性（U/104 cell）=x×V 樣÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量）÷T=1.5×x÷細(xì)胞數(shù)量。
（4）按照培養(yǎng)液體積計(jì)算
酶活性定義：37℃下，每毫升培養(yǎng)液每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活性單位。
幾丁質(zhì)酶活性（U/mL）=x×V 樣÷V 樣÷T =x。
V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.5mL；
V 樣總：加入提取液體積，1.5mL；
W：樣本質(zhì)量，g；
Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；
T：反應(yīng)時(shí)間，1h。

注意事項(xiàng)：
1、反應(yīng)結(jié)束后盡快進(jìn)行比色。
2、吸光值大于1.5 時(shí)，樣品適當(dāng)稀釋再測(cè)定，注意計(jì)算公式里乘以稀釋倍數(shù)；或者縮短37℃水浴時(shí)間到X 小時(shí)（如0.5 小時(shí)），按照原先計(jì)算公式得到的結(jié)果再除以X。